原理：

聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠為載體停止電泳的方法。核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)分子在一定pH值的緩沖液中帶有電荷,將其放人電場(chǎng)中，則可向與其所帶電荷電性相反的電極移動(dòng)。聚丙烯酰胺凝膠具有分子篩效應(yīng)，核酸分子大小、外形不同，故在電場(chǎng)作用下,核酸分子在聚丙烯酰胺凝膠中泳動(dòng)速度不同,依此可到達(dá)分別純化的自的。本文詳細(xì)引見(jiàn)了RNA的聚丙烯酰胺凝膠電泳，包括聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理，實(shí)驗(yàn)所需試劑，實(shí)驗(yàn)步驟。

資料、儀器設(shè)備及試劑

(一)資料

RNA樣品液。

(二)儀器設(shè)備

電泳儀,玻璃管,試管架,穿刺針頭,注射器。

(三)試劑

(1) 20%的單體母液:取重結(jié)晶的丙烯酰胺19.0g及甲叉雙丙烯酰胺1.0g,蒸餾水溶解,稀釋至100mL。

(2) Tris-硼酸一EDTA(TBE)緩沖液:稱Tris 108.8 g,硼酸55.0g, EDTA -Na29.3g蒸餾水溶解,稀釋至1000mL,pH為8.3。用于電極緩沖液時(shí)再稀釋10倍。

(3) β一DMAPN(二甲基氨基丙腈)。

(4) 1.6%過(guò)硫酸銨溶液:稱取0.16 g過(guò)硫酸銨溶于10 ml.水中。

(5) 20%蔗糖-0.2%溴酚藍(lán)溶液:取蔗糖20g,溴酚藍(lán)0.2 g溶子100 mL水中。

(6) 0.2%甲烯藍(lán)染液:取0.2 g甲烯藍(lán)溶于100 mL pH4.7的0.4 mol/L HAc緩沖液中,過(guò)濾后運(yùn)用。

(7) 6%HAc液:取HAc 60 mL加水至1 000 mL。

RNA的聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)步驟：

(一)制膠

(1)取玻管(8 cmx0.5 cm)2支,下端用膠布封鎖管口,垂直立在試管架上。

(2)取單體母液3 mL、緩沖液1.5 mL、β- DMAPN0.06 mL、水10 mL混勻,再加過(guò)硫酸銨0.94mL,混勻后立郎分裝于各管至刻度處，沿玻管加幾滴水封面，靜置待凝結(jié)。

(二)加樣

(1)取大批RNA樣品液和RNA規(guī)范液區(qū)分如人等體積的20%蔗糖和0.2%溴酚藍(lán)待用。

(2)剝?nèi)ツz管下端膠布,倒出凝膠外表水,用電泳緩沖液洗濯凝膠外表三次,凝膠管內(nèi)加滿緩沖液,插人電泳槽中,上下槽加足電泳緩沖液,每支凝膠管加rna樣品10~ 20 μL(含RNA 50~ 100 μg)。

(三)電泳

接通電泳儀電源，上槽接負(fù)極，下槽接正極。末尾時(shí)電流應(yīng)小一些,以每支凝膠1~2mA為宜。待樣品進(jìn)人凝膠后添加至每支凝膠3mA,調(diào)至所需電流并堅(jiān)持。待溴酚藍(lán)遷移至距凝膠管下端2cm處封鎖電源中止電泳,取出凝膠管。

(四)染色及觀察

(1)用5mL注射器吸滿蒸餾水，安上穿刺針頭,針尖緊貼玻管壁,邊旋邊向凝膠管側(cè)壁注入水剝離凝膠。

(2)將凝膠放入染色液中染色1 h,再用6% HAc脫色,改換數(shù)次脫色液,直到背景明晰,普通需脫色24h。

(3)將凝膠泡在6%HAc中,取出后在紫外燈下觀察,比擬不異樣品的電泳區(qū)帶。

DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳引見(jiàn)

（一）操作規(guī)程

1.清洗裝配　用去污劑、水洗凈玻璃板，晾干。然后依照要求裝好。洗濯及裝配玻璃板時(shí)必需戴手套。

2.制膠　確知玻璃板的大小和距離片的厚度，可以得知所需丙烯酰胺溶液的體積（100mL不同濃度凝膠的制備，參見(jiàn)表2-1）。

表2-1　制備聚丙烯酰胺凝膠所用試劑的體積

3.聚合　立刻拔出適當(dāng)?shù)氖嶙印Ｊ覝叵蚂o置聚合5～20分鐘。

4.上樣　向電泳槽中參與電泳緩沖液，小心拔出梳子。用電泳緩沖液沖洗點(diǎn)樣孔。然后上樣。

5.電泳　末尾時(shí)電壓為8V/cm凝膠，染料泳動(dòng)至膠底約1cm時(shí)，中止電泳。

6.剖析　取下凝膠，切除凝膠的一角作為標(biāo)志。染色、剖析。

（二）留意事項(xiàng)

1.電泳前　①整個(gè)操作進(jìn)程中必需戴手套，未聚合的丙烯酰胺為神經(jīng)毒性，可經(jīng)過(guò)皮膚吸收，其作用具累積性。聚合的丙烯酰胺無(wú)毒，但也應(yīng)戴手套，因其能夠含有未聚合資料。②灌注凝膠時(shí)要防止凝膠的走漏，灌注前可用水測(cè)試一下。③一定要反省電極的銜接，正負(fù)極要對(duì)應(yīng)。④要先倒電泳緩沖液，然后上樣，再設(shè)定電泳條件接通電源。⑤調(diào)電流電壓時(shí)，不要超出額外范圍。

2.電泳時(shí)　①電泳進(jìn)程中會(huì)發(fā)生少量的熱，應(yīng)將電泳槽放入冷藏室或冰上停止電泳。②在電泳進(jìn)程中，電泳裝置如有異常發(fā)熱，立刻封鎖電泳儀。

3.電泳后　取出凝膠時(shí)要十分小心，以免凝膠分裂影響剖析。

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