小鼠顱窗的制作和雙光子顯微鏡活體成像為本模型構(gòu)建的難點(diǎn)，對(duì)個(gè)人技術(shù)要求較高，需要長(zhǎng)期練習(xí)并且具有麻醉、解剖、生理等跨學(xué)科知識(shí)儲(chǔ)備。

本模型為同源小鼠膠質(zhì)瘤模型，較異源模型更能模擬臨床上腫瘤病人血管增生，腫瘤彌散性侵襲生長(zhǎng)，尤其是探究膠質(zhì)瘤細(xì)胞在惡性增殖過(guò)程中與免疫細(xì)胞的相互作用關(guān)系。如結(jié)合免疫細(xì)胞表達(dá)特異熒光的轉(zhuǎn)基因小鼠即可探究特定免疫細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤惡性增殖的影響。同時(shí)其它基質(zhì)細(xì)胞，如周細(xì)胞等亦可借助此模型進(jìn)行研究。

C57BL/6購(gòu)自北京唯尚立德生物科技有限公司小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中，機(jī)體內(nèi)無(wú)特定的病原微生物和寄生蟲(chóng)存在。腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)和凍存都嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)流程操作。細(xì)胞和小鼠均沒(méi)有向自然環(huán)境外溢，無(wú)環(huán)境和生態(tài)威脅。

圖2.小鼠膠質(zhì)瘤活體成像。紅色：GL261-Tdtomato，綠色：血管，i.v. FITC-Dextran。深度：0-300 μm。

如上圖2所示，接種腫瘤后第七天，實(shí)體膠質(zhì)瘤已經(jīng)在顱內(nèi)形成，且呈彌散性生長(zhǎng)。白色箭頭顯示的是單個(gè)腫瘤細(xì)胞，綠色箭頭指FITC-Dextran透過(guò)血腦屏障外滲。這說(shuō)明隨著腫瘤生長(zhǎng)，血腦屏障收到破壞。接下來(lái)，第10天、第13天，膠質(zhì)瘤細(xì)胞增長(zhǎng)迅速，直徑已經(jīng)超過(guò)1 mm。并且血管成像顯著的病理性改變。

圖3.小鼠膠質(zhì)瘤惡性增殖并伴隨血管增生。紅色：GL261-Tdtomato，綠色：血管，i.v. FITC-Dextran。深度：0-300 μm。

如上圖3所示，紅色為惡性增殖的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，綠色為不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)血管成像情況。在第10天、13天部分腫瘤區(qū)域未檢測(cè)到紅色熒光信號(hào)，我們推測(cè)可能是腫瘤增長(zhǎng)過(guò)快，導(dǎo)致部分區(qū)域缺血、缺氧出現(xiàn)壞死所致。而從第7天到第13天能明顯看到血管的增生及病理性改變，這與臨床膠質(zhì)瘤患者是一致的。

為了進(jìn)一步量化腫瘤生長(zhǎng)及血管的增生情況，我們將獲取的三位立體圖像通過(guò)Imaris軟件進(jìn)行了重構(gòu)和計(jì)算。結(jié)果如圖4所示，膠質(zhì)瘤和血管的體積和表面積隨著時(shí)間變化有著顯著的增長(zhǎng)過(guò)程。

圖4.小鼠膠質(zhì)瘤及血管的體積和表面積統(tǒng)計(jì)圖。

雖然雙光子活體成像可以動(dòng)態(tài)跟蹤觀察單細(xì)胞水平腫瘤在顱內(nèi)的生長(zhǎng)情況，但是其觀測(cè)深度只能到達(dá)皮層下500-700 μm。為了更全面的展現(xiàn)膠質(zhì)瘤在顱內(nèi)的生長(zhǎng)情況，我們?cè)诤笃谝餐ㄟ^(guò)核磁（Magnetic Resonance Imaging， MRI）對(duì)小鼠的膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)情況進(jìn)行了跟蹤觀察。如下圖5所示，膠質(zhì)瘤在顱窗下生長(zhǎng)迅速。第二十天已經(jīng)跨兩側(cè)腦半球進(jìn)行生長(zhǎng)。在第20天和26天膠質(zhì)瘤分為幾部分生長(zhǎng)，而到了第32天這幾部分已經(jīng)張到一起。直徑也達(dá)到5 mm左右。在獲取了MRI影像學(xué)數(shù)據(jù)后我們也同樣通過(guò)Imaris對(duì)其進(jìn)行了三位立體構(gòu)建，并計(jì)算了其變化情況。結(jié)果顯示其增長(zhǎng)迅速。

圖5.小鼠膠質(zhì)瘤MRI成像及分析。

圖1.小鼠膠質(zhì)瘤活體成像模型構(gòu)建。A. GL261-Tdtomato細(xì)胞系。B. 小鼠顱窗的制作。C. 腫瘤細(xì)胞腦原位接種。D.小鼠腦雙光子活體成像。

模型制作方法如上圖1所示：

首先，將Ubi-MCS-SV40-Neomycin (Genechem Co.,Ltd, Catalog No. CV084)慢病毒載體轉(zhuǎn)染到GL261-WT腫瘤細(xì)胞系內(nèi)，以構(gòu)建可以表達(dá)紅色熒光的GL261-Tdtomato細(xì)胞系。

其次，將小鼠腦部毛發(fā)去除，剪掉皮膚，暴露顱骨后通過(guò)牙科鉆頭鉆一個(gè)直徑約5.0-5.5 mm的孔洞，并將其移除。暴露腦后需要移除硬腦膜，并粘上直徑為6.0 mm的透明玻璃片。

第三，上述手術(shù)三到四周后將顱窗移除，將1 μl包含5×104個(gè)GL261-Tdtomato細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞懸液原位注射到一側(cè)大腦半球，并重新粘上玻璃片，做好顱窗。

第四，約一周后通過(guò)雙光子顯微鏡成像技術(shù)動(dòng)態(tài)跟蹤觀察。

一、疾病概述

膠質(zhì)瘤是指由膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生癌變，惡性增殖而形成的腫瘤，是最為常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。包括多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM, Glioblastomas multiforme）、間變性星形細(xì)胞瘤（AA, Anaplastic astrocytomas）、間變性少支星形細(xì)胞瘤（AOA, Anaplastic oligoastrocytomas）間變性少支膠質(zhì)細(xì)胞瘤（AO, Ananplastic oligodendrogliomas）等1。其中多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）發(fā)病率最高，占所有膠質(zhì)瘤的一半以上，年發(fā)病率約為3.19/10萬(wàn)2。雖然有很多治療手段，如常用的治療方案為手術(shù)，加術(shù)后放療及替莫唑胺（TMZ）同步化療，然后為6個(gè)療程的TMZ單獨(dú)輔助化療。但療效并不盡如人意，總的生存期（OS）僅為12-18個(gè)月3。嚴(yán)峻的現(xiàn)實(shí)急需對(duì)其病理病程進(jìn)行深入研究，探尋新的潛在治療靶位點(diǎn)，以優(yōu)化治療方案，提高患者生活質(zhì)量及生存時(shí)間。

二、研究背景

1、 GL-261膠質(zhì)細(xì)胞瘤信息

GL-261為鼠源膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。是常用的用于膠質(zhì)瘤研究的腫瘤細(xì)胞系，體外培養(yǎng)方便，增值快。體內(nèi)原位注射到小鼠腦后生長(zhǎng)迅速，能很好再現(xiàn)臨床膠質(zhì)瘤血管增生等特征。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

C57BL/6是常用近交系小鼠品系，因其群體基因高度純合和穩(wěn)定，繁殖能力強(qiáng)，壽命長(zhǎng)等因素廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)和其它多項(xiàng)研究領(lǐng)域。

3、研究背景

雖然科學(xué)家建立了很多膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，如GL-261小鼠皮下腫瘤模型4，GL-261腦原位小鼠模型等5。但這些模型不能在單細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)跟蹤觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞在顱內(nèi)的生長(zhǎng)狀況，及與基質(zhì)細(xì)胞和血管的相互作用關(guān)系。雖然，也有科學(xué)家借助雙光子顯微鏡構(gòu)建了小鼠活體成像模型，但其實(shí)驗(yàn)中用到的為免疫缺陷小鼠6，不能很好再現(xiàn)臨床上免疫功能健全的患者膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)與免疫細(xì)胞的相互作用關(guān)系。而應(yīng)用鼠源的GL-261細(xì)胞系及免疫功能健全的C57BL/6小鼠恰能解決這個(gè)問(wèn)題。