免疫共沉淀注意的問(wèn)題

(1)確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生。

(2) 要確?？贵w的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會(huì)引起共沉淀。

(3) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。

注意的問(wèn)題：

(1)細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑(NP40或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。

(2)使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用。

(3)使用對(duì)照抗體：

單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗

兔多克隆抗體：正常兔IgG

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)流程

(1)轉(zhuǎn)染后24-48 h 可收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液(含蛋白免疫共沉淀酶抑制劑)，冰上裂解30min, 細(xì)胞裂解液于4°C， 轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清。

(2)取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1μg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過(guò)夜。

(3)取10 μl protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3 000 rpm離心3 min。

(4)將預(yù)處理過(guò)的10 μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)夜的細(xì)胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連。

(5)免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C 以3 000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底;將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 ml 裂解緩沖液洗3~4次;最后加入15 μl 的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘。

(6)SDS-PAGE， Western blotting或質(zhì)譜儀分析。

免疫共沉淀缺點(diǎn)

(1)可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用;

(2)兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用;

(3)必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。

免疫共沉淀優(yōu)點(diǎn)

(1)相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài);

(2)蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響;

(3)可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。